Sau khi Cách mạng tháng Tám 1945 thành công, ông được Việt Minh giao nhiệm vụ chữa bệnh cho Hồ Chí Minh. Trong thời gian đó, ông đã viết cuốn sách tóm tắt kinh nghiệm nghiên cứu về giun với vấn đề "Viêm tụy cấp tính và phẫu thuật". Đây là cuốn sách khoa học thuộc ngành Y được xuất bản đầu tiên tại nước Việt Nam Dân chủ Cộng hòa.

Một thời gian sau, ông được cử làm Giám đốc bệnh viện Phủ Doãn và cùng với giáo sư Hồ Đắc Di, ông đã bắt tay xây dựng Trường Đại học Y Hà Nội. Sau khi Pháp nổ súng tái xâm lược Đông Dương, ông tham gia tổ chức cứu chữa thương bệnh binh, xây dựng các tuyến mổ xẻ như ở mặt trận Tây Nam Hà Nội cùng các bác sĩ Nguyễn Hữu Trí, Hoàng Đình Cầu,...

Trong thời kỳ chiến tranh ác liệt, ông vẫn tham gia tổ chức điều trị, phát triển ngành y tế, đồng thời với nghiên cứu khoa học, với đào tạo sinh viên, xây dựng nền tảng trường Y khoa Việt Nam, dù phải di chuyển nhiều lần, ở nhiều địa bàn như Vân Đình, Hà Đông (1946), Lăng Quán, Tuyên Quang (1947), Phù Ninh, Phú Thọ (1948), Đại Lục, Phú Thọ (1949), Chiêm Hóa, Tuyên Quang (1950),... Ông cũng được cử làm làm cố vấn phẫu thuật ngành quân y ở Bộ Quốc phòng. Cũng trong thời gian này, cùng với Giáo sư Đặng Văn Ngữ, ông đã góp phần sản xuất penicillin phục vụ thương bệnh binh trong điều kiện dã chiến.

Năm 1947, ông được cử giữ chức Thứ trưởng Bộ Y tế và giữ chức vụ này cho tới năm 1961.

Từ năm 1954, ông làm Giám đốc bệnh viện Hữu nghị Việt Đức, và giữ cương vị Chủ nhiệm Bộ môn Ngoại Đại học Y Dược Hà Nội. Ông đề cao việc tiếp thụ y học phương Tây để xây dựng và phát triển nền y học của Việt Nam, nghiên cứu bệnh tật và chữa trị cho người Việt Nam, đi đầu trong việc áp dụng các kỹ thuật phát triển ngành ngoại khoa Việt Nam. Ông là người đầu tiên mổ tim ở Việt Nam nǎm 1958. Trong những năm 1960, ông đã nghiên cứu thành công phương pháp "cắt gan có kế hoạch", thường được gọi là "phương pháp mổ gan khô" hay "phương pháp Tôn Thất Tùng". Ông cũng là người đặt nền móng cho việc nghiên cứu tác hại của chất độc hóa học điôxin đến con người và môi trường tại Việt Nam, phương pháp điều trị các vết thương do bom bi, phương pháp điều trị ung thư gan bằng phẫu thuật kết hợp dùng miễn dịch và rất nhiều công trình khoa học khác.

Ông mất ngày 7 tháng 5 năm 1982 tại Hà Nội, thọ 70 tuổi; An táng tại Nghĩa trang Mai Dịch – Hà Nội.[2]